冷冻制样机理以及新技术
1. 消除蛋白质快速漂移
《QRB discovery》杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所章新政课题组的研究论文"Low-cooling-rate freezing in biomolecular cryo-electron microscopy for recovery of initial frames"。文章发现了在冷冻电镜成像过程中导致电子束诱导蛋白质样品快速漂移的新机制，并提出通过降低冷却速率制备无快速漂移的冷冻电镜样品的新方法。该方法对可以有效恢复辐照损伤最少，含最多高分辨信号的成像数据质量，提升重构分辨率，实现辐照损伤敏感氨基酸的高分辨重构，并且高分辨信号的恢复为冷冻电镜达到原子分辨率打下基础。
1980s，Dubochet把含水样品快速投入到-183℃的液态乙烷中，制备包埋在玻璃态冰中的低温样品来减少生物样品受高能电子束照射产生的损伤。一般认为，降温速率越大越容易实现玻璃态冰的生产。但是玻璃态冰中的蛋白质在电子束照射初期会产生快速漂移，无法矫正，使冷冻电镜前几帧成像模糊而无法有效的应用于三维重构。电子束曝光初期的冷冻电镜数据具有最小的辐照损伤，含有最主要的高分辨信号，所以电子束诱导的快速漂移是实现原子分辨率结构解析以及易辐照损伤氨基酸高分辨重构所需要克服的壁垒，被Richard Henderson在2017年的诺贝尔奖报告中称为冷冻电镜中的"Key outstanding problem"。
经过近5年的攻关，我们发现快速漂移源自玻璃态冰在急速冻结时产生的应力，该应力和过高的降温速率相关，可以通过降低冷却速率来减少。通过优化冷冻制样技术，降低冷冻过程中的样品降温速率，我们最终实现了蛋白质快速漂移的消除（图1）。通过降低冷却速率制备得到的冷冻样品，我们的数据分析展示冷冻电镜前几帧数据被有效恢复，从恢复的电子密度图中我们可以清晰看到在普通冷冻样品结构中无法得到的辐照损伤敏感的氨基酸侧链信息。
中国科学院生物物理研究所章新政研究员为本文的通讯作者，章新政课题组博士生吴春玲和石会刚为文章的共同第一作者。中国科学院生物物理研究所范克龙研究员为课题提供主要样品，中国科学院生物物理研究所与中国科学技术大学联合培养博士生朱东杰也为该项成果贡献了力量。
图1. 降低样品冷却速率消除快速漂移示意图。a. 通过降低样品冷却速率，冷冻电镜前几帧数据明显恢复。b-c. 增加载网与镊子的传热在载网形成的冷却速率梯度和在不同冷却速率下GDH样品前几帧的恢复情况。d-e. 提高液态乙烷温度至-110℃时制备的铁蛋白样品，及在不同温度下铁蛋白前几帧的恢复情况。f. 冷冻电镜前几帧恢复后，易受辐照损伤的氨基酸侧链密度图对比。
2. 减少取向优势问题
冷冻电镜三维重构需要蛋白质在冷冻制样时取向随机的分布在非晶冰中，然而气液界面常常导致蛋白质，特别是可溶性蛋白质在非晶冰中出现优势取向分布，严重情况下使的三维数据不完整，无法进行重构，是目前单颗粒冷冻电镜技术对蛋白质进行结构解析时易遇到的主要瓶颈问题。前期研究表明，气液界面具有疏水性，可以使得处于气液界面上的蛋白质变性。因此，气液界面往往被认为通过疏水相互作用吸附部分变性的蛋白质，从而导致优势取向问题。
中国科学院生物物理研究所章新政课题组李不凡针对冷冻电镜三维重构中常见的蛋白质优势取向问题开展机制研究，发现蛋白质吸附于气液界面，其取向由气液界面携带的电荷控制（图2）。常规的冷冻制样中气液界面携带负电荷，负电荷对蛋白质的吸附导致了蛋白质分布的取向优势。研究还发现通过运用带正电的去污剂调制气液界面的电荷性质，可以引入蛋白质新的取向数据，实现蛋白质取向问题的改善。而这个工作提出了电荷相互作用是许多蛋白质吸附于气液界面的主要因素，为克服气液界面导致的冷冻制样问题提供了新的思路。相关研究成果近期发表在《Journal of Structural Biology》杂志上。
中国科学院生物物理研究所章新政课题组博士生李不凡为第一作者，章新政研究员为本文的通讯作者。
图2. 蛋白质通过布朗运动至气液界面附近，被由带负电的气液界面形成的势阱捕获的示意图。捕获的过程为蛋白质的旋转使其在势阱中的能量最低。最低能量状态决定优势取向分布。
文章链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1047847721000885
（供稿：章新政研究组）
